次聲波是頻率在0.0001～20Hz范圍內的機械振動波。次聲波在空氣傳播中具有傳播遠、衰減少,穿透力強等物理學特性,次聲廣泛存在自然界、生活環境、生產環境和軍事環境中。一定聲壓級水平的次聲波作用一定時間可致人體功能障礙,甚至器質性損傷。因此,研究次聲的發生、傳播、生物學作用機制及制訂相應的防護措施已越來越受到人們的重視。特別是近年來,一些發達國家投入大量的人力和財力,用于研究次聲的生物學效應,并重視作為非致死性新概念武器——次聲武器在戰爭中的作用研究,相關的文獻報道也逐年增多。同時,較低聲壓級水平和較短時間作用可能會具有良好的刺激效應,因此低強度的次聲在醫療上的應用也引起了關注,例如研究應用次聲治療慢性膽囊炎、屈光不正等。
骨組織作為對應力敏感的組織部分,次聲波對骨生成重建的研究目前尚未見報告。本課題觀察了較低作用劑量的次聲對骨生成的促進作用,并進一步采取體外培養的方式,研究觀察較低強度的次聲對成骨樣細胞增殖分化的影響以及對細胞外基質OPN和ON的mRNA表達和細胞骨架F-actin表達的影響,探討較低作用劑量的次聲促進骨生成的機理。
課題共分四部分實驗:
第一部分--次聲改善雄性去勢大鼠骨質疏松的試驗研究
目的: 觀察較低強度的次聲波作用于雄性去勢大鼠后,其股骨骨質變化的情況。
方法: 32只3月齡SD雄性大鼠,隨機分為正常組、去勢組、去勢后4Hz次聲作用組和去勢后20Hz次聲作用組,大鼠行雙側睪丸切除術(正常組行假手術)。次聲壓力艙系統及次聲檢測系統由第四軍醫大學與航天工業總公司及中科院聲學所協作研制。各組大鼠術后分組置于次聲壓力艙內進行次聲作用,其中前兩組無次聲輸出;后兩組次聲參數分別為4Hz/100dB和20Hz/100dB;每組30min/d,每周作用5日,連續作用12周后處死。在處死大鼠前的第11d和第3d給與鈣黃綠素(5mg/kg)和鹽酸四環素(25mg/kg)皮下注射,進行活體熒光標記;麻醉處死后從心臟抽取血液2ml,放射免疫法測定血清骨鈣素(BGP)濃度;用DPX-IQ型骨密度儀測定左股骨遠端骨密度(BMD);取右側股骨遠端制作脫鈣石蠟切片,測定骨小梁面積百分比(Tb·Ar)、骨小梁寬度(Tb·Th)、骨小梁間隙(Tb·Sp)以及骨小梁數目(Tb·N);取右股骨近端制備硬骨切片,熒光顯微鏡下觀察鈣黃綠素和四環素標記的雙標線,計算骨膜礦化沉積率(MAR)。
結果: 雄性去勢大鼠的血清BGP較正常組降低(p0.05),MAR減少(p0.05),骨小梁寬度、條數、小梁百分比減少,小梁間隙增加(p0.05);4Hz/100dB的次聲作用組,顯著增加了MAR和小梁寬度、條數等形態學指標(p0.05),血清BGP也有增加趨勢;20Hz作用組僅骨小梁寬度和骨小梁數目較去勢組改善(p0.05),余各項指標未有顯著變化;各組股骨遠端BMD無顯著變化。
第二部分--次聲對成骨樣細胞生物學特性的影響
目的: 研究了100dB次聲波對成骨樣細胞MC3T3生物學特性的影響。
方法: 成骨樣細胞MC3T3按1×104/ml濃度接種在4個24孔培養板中,分為4組,置于次聲壓立艙中,分別以不同頻率(4Hz、12Hz、20Hz)對細胞進行100dB次聲作用,30min/d,對照組無次聲輸出。觀察次聲作用5日后細胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OCN)的表達等方面的變化。
結果: 發現次聲作用組MC3T3細胞增殖速度增加,4Hz組和12Hz組細胞密度第3日起增加顯著(p0.05),20Hz組第5日細胞密度增加顯著(p0.05);各頻率組和對照組的細胞ALP表達均較低,但無顯著差異(p﹥0.05);各頻率組細胞OCN表達較對照組明顯增高(p0.01)。
第三部分--次聲作用后MC3T3細胞骨橋素和骨粘連蛋白mRNA表達
目的: 研究100dB不同頻率次聲對成骨細胞細胞外基質骨橋素(osteopontin,OPN)和骨粘連蛋白(osteonectin,ON)mRNA的影響。
方法: 采用4個6孔培養板進行小鼠成骨樣細胞系MC3T3細胞的培養,分別設為對照組、4Hz/100dB組、12Hz/100dB組、20Hz/100dB組。各組進行相應參數的次聲波作用,對照組無次聲輸出,30min/d,在第3d次聲作用后2h、8h分別進行骨橋素(OPN)及骨粘連蛋白(osteonectin,ON)mRNA原位雜交染色,光學顯微鏡下進行圖像分析,測定細胞陽性物質平均灰度,進行分析。
結果: 各組次聲波作用后2h和4h的時間點,OPN mRNA、ON mRNA含量均較對照組顯著升高(p0.05),各次聲作用組間差異不顯著(p0.05);8h后各次聲作用組的mRNA含量下降,和對照組差別不顯著(p0.05)。
第四部分--次聲作用后MC3T3細胞骨架蛋白的動態表達
目的: 研究4Hz/100dB、12Hz/100dB、20Hz/100dB的次聲作用后,小鼠成骨樣細胞細胞MC3T3的細胞骨架F-actin表達的改變。
方法: 將MC3T3細胞接種爬片同第三部分實驗,分為對照組和4Hz/100dB、12Hz/100dB、20Hz/100dB的次聲暴露組。各組分別接受次聲作用30min/d,對照組無次聲輸出。第3d于暴露后2h、4h、8h不同時間,對細胞進行F-actin的免疫熒光染色,應用激光掃描共聚焦顯微鏡,測定單個細胞F-actin的平均熒光強度,觀察細胞F-actin的表達改變。
結果: 對照組細胞大部分熒光物質呈彌漫狀態,胞膜熒光較強,胞漿內少量肌動蛋白纖維絲,方向不規則,長短不一;不同頻率次聲作用后2h,各次聲作用組均可看到胞漿中微絲F-actin明顯粗大纖長,熒光物質大多為較長的粗大應力絲,沿細胞縱軸排列較多,數量及熒光強度明顯增加(p0.05);在不同頻率次聲作用后4h和8h,次聲暴露組的細胞F-actin仍處于較高表達狀態。不同頻率次聲作用組細胞的F-actin變化趨勢較一致,各組在各時間點未見明顯差異(p0.05)。
綜上所述,本課題結果提示:
1. 4Hz /100dB的次聲30min/d共進行12周(每周5日)的作用,可以促進松質骨的生成,增加骨膜礦化沉降率,從而改善了雄性去勢所造成的骨質疏松程度。
2. 體外MC3T3成骨樣細胞培養方式發現:100dB次聲波30min作用可以促進成骨樣細胞的體外增殖和分泌功能,4Hz對細胞體外增殖促進較明顯,而20Hz對促進細胞成熟分化作用較明顯。
3. 100dB的不同頻率次聲每日30min作用能促進成骨細胞的OPN及ON的mRNA表達一過性增高,次聲作用8h后mRNA的表達減弱。
4. 100dB的不同頻率次聲作用30min/d,還可誘導F-actin表達的增強,這種增強改變在次聲作用8h后仍未見減弱。
5. 體外細胞培養實驗在4Hz、12Hz、20Hz間未觀察到明確的“頻率窗”效應。
